PRUEBAS PARA EVALUAR LA INMUNIDAD

METODOLOGÍAS PARA EL ESTUDIO DE LA RESPUESTA INMUNE.

RATONES KNOUT OUT. Se desactiva un gen determinado, por lo que dejan de producir una proteína permiteidno estudiar la función de esa molécula.
ANTICUERPOS MONOCLONADOS (AcMc): Se selecciona un clón de célula productora de un Ac y se inmortaliza fusionandolo con células de mieloma, creando un hibridoma que producirá indefinida/m Ac contra un solo epítope. Permitendo descubrir determinada molécula por ejemplo en una biopsia.
ORGANISMOS TRANSGÉNICOS. Permite clonar determinado gen e insertarlo en una bacteria o levadura y que produzca una proteína purificada (citoquina) y permiten tratar carencias genéticas (como inmunodeficiencias severas).
MICROARRAYS O BIOCHIPS. Son chips que al ser implantados permiten evaluar simultanea/m miles de genes y permite hacer diagnosticos precisos de leucemias y permite planificar una pauta terapeútica. Además permitirá realiINMUNOHISTOLOGÍA E INMUNOHISTOQUÍMICA. Permiten cuantificaer e identiifcar donde una citoquina o célula se genera, migra o se concentra. Además permite identificar [ ] muy bajas o alteraciones mínimas en su estructura no detectables por medios químicos.

EVALUACCIÓN DEL ESTADO INMUNOLÓGICO.

EVALUACCIÓN DE LA INMUNIDAD INNATA.

Permite determinar si la infección es producto de lapatogenicidad del MO o a una deficiencia del SI. Evalua la magnitud de la respuesta inflamatoria y la respueseta a terapeutica en E. Autoinmunes.
INMUNIDAD NATURAL:
QUIMIOTAXIS: Cámara de Borden: Se colocan PMN y una solución quimitáctica separados por una membrana con poros pequeños. Se observa elk número de PMN atrapados en la membrana. Prueba de agarosa: En una capa de agarosa se hacen 3 orificios equidistantes con células en el central y buffer y quimiotacticos en los pozos laterales, se cuantifica el desplazamiento. Prueba de orientación: En una cámara de Zygmondse colocan dos pozos separados entre si, uno con buffer y otro con quimiotácticosse coloca sobre ellos una laminilla con células boca abajp, se cuantifica la dirección y orientación. Puebla de MIF: Los Mos migran en forma de abanico hacia el medio de cultivo normal/m desde un tubo capilar, si s eintroducen Ls y un Ag al cual atacar forman MIF y la disposición en abanico no se presenta.
FAGOCITOSIS. Cuenta y obervación de leucocitos para evaluar alteraciones cuantitativas y cualitativas. Se mide por: Captura de S. Aureus marcada con C14 radiactivo, ensayo morfológico (se colocan bacterias o partículas inertes en una suspensión de Lcs, se observa la cantidad de PMN que tienen en us interio la partícula. Actividad bactericida: Cuantifica el número de bacterias o partículas destruidas Otras pruebas detectan anormalidades enzimaticas de leucocitos. Prueba NBT (nitroblue tetrazoilum Test): Los fagocitos activados incorporan este colorante a su citoplasma y se reduce por la producción de H2O2 fdormando precipitados insolubles IC. La no captación se debe a deficiencia de DNA-DPH-oxidasa, como en la enfermedad granulomatosa crónica (tamiz).
VENTANA DE REBUCK. Se hace una herida en la piel por la que se introduce un cubreobjetos, se cmabia cada 2 horas por 24 horas. Estudia la cantidad y tipo de células que acuden a la defensa, en las primeras 6 horas hay PMN después son sutituidos por Mos. Quimioilumiscencia: Mide la luz emitida por PMNmetabolica/m activos.
EVALUACCIÓN DE LA INFLAMACCIÓN. La PCR y la eritrosedimentación son marcadores inespecíficos de inflamación. Prueba de liberación de histamina: Mide la degranulacción d elos basofilos, las pruebas de Osler y Campbell permiten determinar la magnitud del proceso. Se pueden evaluar el complenmento por pruebas de inmunodifusión radial, son utiles para determinar la magnitud de la inflamación pricipal/m en EAI.

EVALUACCIÓN DE LA INMUNIDAD CELULAR ESPECÍFICA.

ESTENDIDO DE SANGRE: Ausencia o disminución de Ls. Recuento total de Ls en sangre periférica: Menos de 1000/mm3 indica deficiencia. El recuento debe acerse en varias ocasiones el conteo puede disminuir en infecciones virales y vacunaciones. Por centrifugacción (densidad diferencial) puede separarse una cap ,don de solo hay Ls y Mos. La separación de LsT anterior/m se realizaba por la pueba de las rosetas (Los LsT se unen espontánea/m a los GR de carnero). Actual/m se utilizan AcMc que permiten caracterizar las subpoblacciones: LsT CD3+ 75% (CD4+ 70%, yd 5% y 25% CD8+), LsB IgG (18%) y Nks CD16 (7%). Citometría de flujo: utiliza IF o potenciales detectables de rayo laser para detectar los AcMc, para elk recuento de subpoblacciones de Ls aún en números muy limitados. Clasificación del desarrollo morfológico: Con AcMc, determina el grado de desarrollo y madureEVALUACCIÓN DE LA INMUNIDAD PREEXISTENTE. Por intradermorreacciones (IDR) con antígenos como tuberculina, tricofitina y algunos prevalenctes en ciertas regiones (coccidioidina, histoplasmina), la negatividad indica falta de contacto con el antígeno (poco posible) o insuficiencia inmunológica celular. Puede acudirse a fitohemaglutinina, de ser negativas en aconsejable una biopsia rectal que permite evaluar las C. Plasmáticas, su ausencia an la lámina propia indica deficiencia local de IgA.
SENSIBILIZACCIÓN ACTIVA. Se utiliza 2-4 dinitroclorobenceno en solución al 30% (al 10% para niños), se pone en la cara anterior del antebrazo una rueda de papel filtro de 1 cm. de diámetro como 0.05 ml. se solución y se retira 14 horas después. 14 a 21 se vuelve aplicar (al 0.10%) y se remueve 12 a 24 horas mas tarde, obteniendose respuesta a las 48 horas. General/m produce roncha de 0.5 a 3 cm. de diámetro.
TRANSFORMACCIÓN DE LOS LS. Al entra ren contacto con el Ag sufren alteraciones especiales que los llevan a su actividad mitótica. Se estudia su capaciudad d etransformacciónb y multiplicación a través de sustancias que sin ser antigénicas estimulan la transformación de los Ls (cocanavalina y fitohemaglutinina) observando su transformación biológica y la incorporación de la • H- timidita maracada. La no transformación indica deficiencia de los LsR.
DETECCIÓN DE CITOQUINAS Y SU CUANTIFICACAIÓN. Varios métodos: Ensayo funcional o de actividad biológica: Utilizando células dependientes de una citoquina o aquellas que son sensibles a su efecto citotóxico. Enzayo inmunoenzimático (ELISA): Con AcMc. Detección de mARN: a través de PCR de transcripcción reversa (RT-PCR).

EVALUACCIÓN DE LA INMUNIDAD HUMORAL.

METODOS DIRECTOS: La dosificación total nos permite tener una dide a de la capacidad para formar Igs. Pueden existir deficiencia total (agammaglobulinemias), en otra puede ser parcial limitandose a la carencia de una o varias, pueden evaluarse por electroforesis (alteraciones muy marcadas) p inmunofloresis Con Acs contra Igs, en las zonas de contacto se establecen bandas de precipitación que indican que la Ig esta presente y el tamaño de labanda da una idea de la cantidad.
DOSIFICACIÓN INDIVIDUAL. Las Igs G, M y A pueden dosificarse facil/m con inmunodifusión radial, la IgM sirve para determinar si hay infección aguda y la IgG para infección crónica. La nefelometría dosifica [ ] de Igs (Para dosificar IgE total circulante).
MÉTODO INDIRECTO. Dosificacciónm de un Ac previa inmunización. Se emplea vacuna inactiva de lapolio o DPT (0.5 cc por 3 ocasoiones con intervalo de una semana, 14 días mastarde se toma una muestra de sangre). Western Blot o inmunoblot: En ge lagar con Ac marcados. Para confirmar pruebas de ELISA (diagnostico sospechoso de VIH).
EVALUACCIÓN DE REACCIONES AC-AG. Por pruebas de precipitación, floculacción, aglutinación, fijación y por mediuo de pruebas indirectas de isótopos radiactivos o colorantes flourecentes.
REACCIONES DE PRECIPITACCIÓN. In vivo: al unirse un Ag soluble con un Ac, los IC son fagocitados por SER, excepto cuando una disminución congénita d elos receptores Fc. In Vitro: Se ponen en tubos de ensayo una [ ] fija de Ac y dosis crecientes de Ag. En los primeros habra excedente de Acs, en los útimos de Ag. La cantidad de IC se mide por precipitación o con centrifugacción que los concetra en el fondo. In Vitro y fase sólida: En agar se hacen dos pozos uno con Ags y otro con Acs, la smoléculas empiezan a migrar y terminan por encontrarse formando una banda de precipitación. Flourometría: Las Igs, como toda proteína emiten flouerecencia en el espectro de luz UV; el cual desciende si son cubiertos por otra molécula (esta prueba mide flourecencia). Inmunodifusión doble: Permite la evaluación de la reacción cruzada y detección de Acs Ag específicos, en una fáse sólida (agarosa) se coloca un pozo central con Ag soluble y en los perrifñericos suero, 2 positivos y otros 4 con suero de pacientes a estudiar. Puede obtnerse un patrón d ebandas de: Identidad (ambos sueron tienen Acs contra el mismo epítope), no identidad (Los sueron tienen Acs dirigidos contra otros epítopes del Ag) o de identidad: Presentan Acs contra epítopes relaccionados pero no idénticos. Inmunodifusión radial: En placas de agar se ponen [] preestablecidas de Acs contra determinado Ag. En lo pozos el suero con Ag a dosificar, el tamño del halo o corona da idea de la presencia del Ag y su cantidad, se utiliza para identificar Igs y algunos facotores del complemento. Inmunoelectroforésis cruzada: para Igs y factores del complemento.
AGLUTINACCIÓN: Cuando un Acs se une a Ags presentes en la superficie d euna célula esta glutina, sirve para: Pueba de Weil felix(tifo exantemático) y Nidal (Fiebre tifoidea), grupos ABO y Rh. La aglutinación de los GR puede ser difícil por las cargas + en la superficie por el ácido ciálico (es removido por tripsina facilitando la reacción). La dosificación de algunos virus y hormonas presentes en la MC se hace aglutinando las células a través de Acs contra el virus u hormona. Prueba de Coobs: Aunque la superficie de los GR sea cxubierta por IgG no sufrirá aglutinación. Estos Acs pueden ponerse en evidencia con Anto IgG de sangre d econejo. Si produce aglutinación será +, indicando que la anemia hemolítica es autoinmune. Aglutinación de partículas cubiertas con Acs. Se usan partículas d elátex o de ventonita que se adieren a un Ag. Es útil para la dodificacción de hormonas, FR y algunas infecciones (triquinosis e histoplasmosis). Hemaglutinacciones: Permite identificar el grupo ABO, la mononucleosis infecciosa, los Acs contra VEB atacan a los GR de carnero. Aglutinan algunos virus en la sueprfice d eGR. Prueba de inhibición de la hemoaglutinación: Ciertos virus (influenza, paperas y para influenza) aglutinan GR de caballo o pollo, los adenovirus de rata, si se utilizan Acs contra estos virus se evita la aglutinación (muy específica).
FIJACCIÓN DEL COMPLEMENTO: Ya que las reacciones Ag-Ac que activan el complemento no dan ninguna manifestación in Vitro, se utiliza un indicador GR de carnero. Si hay reacción Ag-Ac el complemento se consumirá en la preimera reacción y no habrá lisis de lso eritrocitos. Se puede medir la activida total del complemento por la técnica CH50, para estudio de EAI y monitoreo de los rehazos, cuantificando individuak/m C3 (su disminución indica actividad sostenida del sistema) y C4 (su disminución activacción del ssitema por vía alterna) por inmunodifusión radial. Si la actividad local esta baja a pesar de [ ] de C3 y C4 pueden cuantidficarse los otros 20 componenete sen laboratorios muy especializados.
PRUEBAS DE CITOTOXINAS. Permiten identificación y detección de Acs específicos en la Mc por lisis de las células blanco en presencia d ecomplemento. El aumento en la permeabilidad puede detectarse mediante un colorante como el azul triptano que penetrara en la célula. Además permite la purificación de subpoblaciones por la depleción de células con determinado Ag.
ANTICUERPOS FLOURECENSTES: Es mas sensible y permite detectar pequeñas cantidad de Acs, qu se hallan fijado a células o tejidos o que esten en solución. Permitiendo hacer Dx. infecciosos rapida/m, s eutilizan Anti Acs (antiglobuñlina marcada con fluoresceína). La IF puede ser directa o indirecta (lavado previo, para remover exceso de Acs).
RADIOINMUNOENSAYO. Se emplea un Ag márcado con isótopo radiactivo que se coloca en la solución donde esta el Ag que se desea medir se agrega el Ac (se mide la [ ] con base en la competencia entre Ag marcados y no marcados). Es muy sensible. También puede detectar Acs contra un determinado Ag: se utilizan Anti acs marcados con isótopo.
ELIZA O PRUEBAS INMUNOENZIMÁTICAS: Se le adhiere a la reacción Ag-Ac una enzima que suele ser peroxidasa o fosfatasa alcalina. Cuando ocurre la acción Ag-Ac estas enzimas actúan como colorantes, y pueden medirse fotocolorimetrica/m. Es el inmunoensayo mas preciso y esquisito para medir [ ] bajas de Ag, droga u hormona.